የማይክሮባይል ሜታፕሮቲሞሚክስ፡ ከናሙና ሂደት፣ መረጃ መሰብሰብ እስከ መረጃ ትንተና

Wu Enhui፣ Qiao Liang*

የኬሚስትሪ ክፍል, ፉዳን ዩኒቨርሲቲ, ሻንጋይ 200433, ቻይና

ረቂቅ ተሕዋስያን ከሰው ልጅ በሽታዎች እና ጤና ጋር በቅርበት የተያያዙ ናቸው. የጥቃቅን ማህበረሰቦችን ስብጥር እና ተግባራቸውን እንዴት መረዳት እንደሚቻል አስቸኳይ ጥናት የሚያስፈልገው ትልቅ ጉዳይ ነው። በቅርብ ዓመታት ውስጥ ሜታፕሮቲሞሚክስ ረቂቅ ተሕዋስያንን ስብጥር እና ተግባር ለማጥናት አስፈላጊ የቴክኒክ ዘዴ ሆኗል. ነገር ግን በተህዋሲያን ማህበረሰብ ናሙናዎች ውስብስብነት እና ከፍተኛ ልዩነት ምክንያት የናሙና ሂደት፣ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መረጃን ማግኘት እና የመረጃ ትንተና በአሁኑ ጊዜ በሜታፕሮቲሞሚክስ የተጋረጡ ሶስት ዋና ዋና ተግዳሮቶች ሆነዋል። በሜታፕሮቲሞሚክስ ትንታኔ ውስጥ ብዙውን ጊዜ የተለያዩ የናሙና ዓይነቶች ቅድመ አያያዝን ማመቻቸት እና የተለያዩ ጥቃቅን ተህዋሲያን መለየት ፣ ማበልጸግ ፣ ማውጣት እና የሊሲስ እቅዶችን መቀበል ያስፈልጋል ። ከአንድ ዝርያ ፕሮቲኦም ጋር በሚመሳሰል መልኩ በሜታፕሮቲሞሚክስ ውስጥ ያለው የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መረጃ ማግኛ ሁነታዎች በመረጃ ላይ የተመሰረተ ማግኛ (ዲዲኤ) ሁነታ እና ከመረጃ-ነጻ ማግኛ (DIA) ሁነታን ያካትታሉ። የ DIA መረጃ ማግኛ ሁኔታ የናሙናውን የፔፕታይድ መረጃ ሙሉ በሙሉ ሊሰበስብ እና ትልቅ የእድገት አቅም አለው። ይሁን እንጂ በሜታፕሮቲሞም ናሙናዎች ውስብስብነት ምክንያት የዲአይኤ መረጃ ትንተና የሜታፕሮቲሞሚክስ ጥልቅ ሽፋንን የሚያደናቅፍ ትልቅ ችግር ሆኗል. ከመረጃ ትንተና አንጻር በጣም አስፈላጊው ደረጃ የፕሮቲን ቅደም ተከተል የውሂብ ጎታ ግንባታ ነው. የውሂብ ጎታው መጠን እና ሙሉነት በመታወቂያዎች ብዛት ላይ ትልቅ ተጽእኖ ብቻ ሳይሆን በአይነቱ እና በተግባራዊ ደረጃዎች ላይ ያለውን ትንታኔም ይነካል. በአሁኑ ጊዜ የሜታፕሮቲሞም ዳታቤዝ ግንባታ የወርቅ ደረጃ በሜታጂኖም ላይ የተመሰረተ የፕሮቲን ቅደም ተከተል ዳታቤዝ ነው። በተመሳሳይ ጊዜ፣ በድጋሜ ፍለጋ ላይ የተመሰረተ የህዝብ ዳታቤዝ ማጣሪያ ዘዴ ጠንካራ ተግባራዊ ጠቀሜታ እንዳለው ተረጋግጧል። ከተወሰኑ የመረጃ ትንተና ስልቶች አንፃር በፔፕታይድ ላይ ያተኮሩ የዲአይኤ መረጃ መተንተኛ ዘዴዎች ፍፁም ዋና ነገርን ያዙ። በጥልቅ ትምህርት እና አርቴፊሻል ኢንተለጀንስ እድገት የማክሮ ፕሮቲኦሚክ መረጃ ትንተና ትክክለኛነትን ፣ ሽፋንን እና የመተንተን ፍጥነትን በእጅጉ ያሳድጋል። የታችኛው የባዮኢንፎርማቲክስ ትንተና በቅርብ ዓመታት ውስጥ ተከታታይ የማብራሪያ መሳሪያዎች ተዘጋጅተዋል, ይህም በፕሮቲን ደረጃ, በፔፕታይድ ደረጃ እና በጂን ደረጃ የማይክሮባዮል ማህበረሰቦችን ስብጥር ለማግኘት የዝርያ ማብራሪያዎችን ማከናወን ይችላል. ከሌሎች የኦሚክስ ዘዴዎች ጋር ሲነጻጸር, የማይክሮቢያዊ ማህበረሰቦች ተግባራዊ ትንተና የማክሮፕሮቲሞሚክስ ልዩ ባህሪ ነው. ማክሮፕሮቲኦሚክስ የብዙ-ኦሚክስ የጥቃቅን ማህበረሰቦች ትንተና አስፈላጊ አካል ሆኗል፣ እና አሁንም ከሽፋን ጥልቀት፣ የማወቅ ትብነት እና የመረጃ ትንተና ምሉእነት አንፃር ትልቅ የእድገት አቅም አለው።

01 ናሙና ቅድመ-ህክምና

በአሁኑ ጊዜ የሜታፕሮቲሞሚክስ ቴክኖሎጂ በሰው ልጅ ማይክሮባዮም ፣ በአፈር ፣ በምግብ ፣ በውቅያኖስ ፣ በንቁ ዝቃጭ እና በሌሎች መስኮች ምርምር ላይ በሰፊው ጥቅም ላይ ውሏል ። ከአንድ ዝርያ ፕሮቲዮም ትንተና ጋር ሲነጻጸር፣ ውስብስብ ናሙናዎች ሜታፕሮቲኦም ቅድመ-ህክምና ተጨማሪ ፈተናዎች ያጋጥሟቸዋል። በትክክለኛ ናሙናዎች ውስጥ ያለው ረቂቅ ተሕዋስያን ስብስብ ውስብስብ ነው, ተለዋዋጭ የተትረፈረፈ መጠን ትልቅ ነው, የተለያዩ አይነት ረቂቅ ተሕዋስያን የሕዋስ ግድግዳ መዋቅር በጣም የተለያየ ነው, እና ናሙናዎች ብዙውን ጊዜ ከፍተኛ መጠን ያለው ፕሮቲኖችን እና ሌሎች ቆሻሻዎችን ይይዛሉ. ስለዚህ, በ metaproteome ትንተና ውስጥ ብዙውን ጊዜ የተለያዩ አይነት ናሙናዎችን ማመቻቸት እና የተለያዩ ጥቃቅን ተሕዋስያንን መለየት, ማበልጸግ, ማውጣት እና የሊሲስ እቅዶችን መቀበል አስፈላጊ ነው.

ከተለያዩ ናሙናዎች ውስጥ ማይክሮቢያል ሜታፕሮቲሞሞችን ማውጣት አንዳንድ ተመሳሳይነት እና አንዳንድ ልዩነቶች አሉት, ነገር ግን በአሁኑ ጊዜ ለተለያዩ የሜታፕሮቲሞም ናሙናዎች የተዋሃደ የቅድመ-ሂደት ሂደት እጥረት አለ.

02Mass spectrometry ውሂብ ማግኛ

በሾት ሽጉጥ ፕሮቲኖም ትንተና ፣ ከቅድመ-ህክምና በኋላ ያለው የፔፕታይድ ድብልቅ በመጀመሪያ በ chromatographic አምድ ውስጥ ተለያይቷል ፣ እና ከዚያ ionization በኋላ መረጃ ለማግኘት ወደ ጅምላ ስፔክትሮሜትር ይገባል ። ከነጠላ ዝርያ ፕሮቲን ትንተና ጋር በሚመሳሰል መልኩ፣ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መረጃ ማግኛ ሁነታዎች በማክሮ ፕሮቲን ትንተና ውስጥ የዲዲኤ ሞድ እና የ DIA ሁነታን ያካትታሉ።

የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መሳሪያዎችን ቀጣይነት ባለው ድግግሞሽ እና ማሻሻያ አማካኝነት ከፍተኛ ስሜታዊነት እና መፍታት ያላቸው የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መሳሪያዎች በሜታፕሮቲኦም ላይ ይተገበራሉ እና የሜታፕሮቲሞም ትንተና ሽፋን ጥልቀትም ያለማቋረጥ ይሻሻላል። ለረጅም ጊዜ በኦርቢትራፕ የሚመራ ተከታታይ ከፍተኛ ጥራት ያለው የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መሳሪያዎች በሜታፕሮቲኖም ውስጥ በስፋት ጥቅም ላይ ውለዋል.

የዋናው ጽሑፍ ሠንጠረዥ 1 ከ2011 እስከ አሁን ባለው የናሙና ዓይነት፣ የትንታኔ ስልት፣ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መሣሪያ፣ የማግኘት ዘዴ፣ የትንታኔ ሶፍትዌር እና የመለያ ብዛትን በተመለከተ አንዳንድ ወካይ ጥናቶችን በሜታፕሮቲኦሚክስ ላይ ያሳያል።

03Mass spectrometry ውሂብ ትንተና

3.1 የዲዲኤ መረጃ ትንተና ስትራቴጂ

3.1.1 የውሂብ ጎታ ፍለጋ

3.1.2ደ ኖቮቅደም ተከተል ስልት

3.2 የ DIA መረጃ ትንተና ስትራቴጂ

04የዝርያዎች ምደባ እና ተግባራዊ ማብራሪያ

በተለያዩ የታክሶኖሚክ ደረጃዎች ውስጥ የሚገኙት የማይክሮቢያል ማህበረሰቦች ስብጥር በማይክሮባዮም ምርምር ውስጥ ካሉት ቁልፍ የምርምር ቦታዎች አንዱ ነው። በቅርብ ዓመታት ውስጥ, የማይክሮቢያዊ ማህበረሰቦችን ስብጥር ለማግኘት በፕሮቲን ደረጃ, በፔፕታይድ ደረጃ እና በጂን ደረጃ ላይ ዝርያዎችን ለማብራራት ተከታታይ የማብራሪያ መሳሪያዎች ተዘጋጅተዋል.

የተግባር ማብራሪያው ይዘት የታለመውን የፕሮቲን ቅደም ተከተል ከተግባራዊው የፕሮቲን ተከታታይ የውሂብ ጎታ ጋር ማወዳደር ነው። እንደ GO, COG, KEGG, eggNOG, ወዘተ የመሳሰሉ የጂን ተግባር ዳታቤዝ በመጠቀም የተለያዩ የተግባር ማብራሪያ ትንታኔዎች በማክሮፕሮቲኦሞች ተለይተው በሚታወቁ ፕሮቲኖች ላይ ሊደረጉ ይችላሉ. የማብራሪያ መሳሪያዎች Blast2GO፣ DAVID፣ KOBAS፣ ወዘተ ያካትታሉ።

05 ማጠቃለያ እና እይታ

ረቂቅ ተሕዋስያን በሰው ጤና እና በሽታ ላይ ትልቅ ሚና ይጫወታሉ. በቅርብ ዓመታት ውስጥ ሜታፕሮቲሞሚክስ የማይክሮባላዊ ማህበረሰቦችን ተግባር ለማጥናት አስፈላጊ ቴክኒካዊ ዘዴ ሆኗል. የሜታፕሮቲሞሚክስ ትንተና ሂደት ነጠላ-ዝርያዎች ፕሮቲዮሚክስ ጋር ተመሳሳይ ነው, ነገር ግን በሜታፕሮቲሞሚክስ የምርምር ነገር ውስብስብነት ምክንያት በእያንዳንዱ የመተንተን ደረጃ የተወሰኑ የምርምር ስልቶችን መውሰድ ያስፈልጋል, ከናሙና ቅድመ-ህክምና, መረጃን እስከ መረጃ ትንተና ድረስ. በአሁኑ ጊዜ ለቅድመ ሕክምና ዘዴዎች መሻሻል ፣ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ቴክኖሎጂ ቀጣይነት ያለው ፈጠራ እና የባዮኢንፎርማቲክስ ፈጣን እድገት ፣ metaproteomics በመለየት ጥልቀት እና የትግበራ ወሰን ውስጥ ትልቅ እድገት አሳይቷል።

የማክሮፕሮቲሞም ናሙናዎችን ቅድመ-ህክምና ሂደት ውስጥ, የናሙናውን ባህሪ በመጀመሪያ ግምት ውስጥ ማስገባት ያስፈልጋል. ረቂቅ ተሕዋስያንን ከአካባቢ ሴሎች እና ፕሮቲኖች እንዴት መለየት እንደሚቻል ማክሮ ፕሮቲዮሞች ከሚገጥሟቸው ቁልፍ ተግዳሮቶች አንዱ ሲሆን በመለያየት ቅልጥፍና እና በማይክሮባዮሎጂ መጥፋት መካከል ያለው ሚዛን ሊፈታ ያለበት አስቸኳይ ችግር ነው። በሁለተኛ ደረጃ, ረቂቅ ተሕዋስያን ፕሮቲን ማውጣት በተለያዩ ባክቴሪያዎች መዋቅራዊ ልዩነት ምክንያት የተፈጠረውን ልዩነት ግምት ውስጥ ማስገባት አለበት. በክትትል ክልል ውስጥ ያሉ የማክሮፕሮቲሞም ናሙናዎች እንዲሁ የተወሰኑ የቅድመ-ህክምና ዘዴዎችን ይፈልጋሉ።

ከጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መሳሪያዎች አንፃር፣ ዋና ዋና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መሳሪያዎች እንደ LTQ-Orbitrap እና Q Exactive to mass spectrometers በ ion ተንቀሳቃሽነት ላይ የተመሰረቱ የበረራ ጊዜ-ውጭ የጅምላ ተንታኞች እንደ timsTOF Pro በመሳሰሉት የኦርቢትራፕ የጅምላ ተንታኞች ላይ በመመስረት ከጅምላ ስፔክትሮሜትሮች ሽግግር አድርገዋል። . የ timsTOF ተከታታይ የ ion ተንቀሳቃሽነት ልኬት መረጃ ያላቸው መሳሪያዎች ከፍተኛ የመለየት ትክክለኛነት፣ ዝቅተኛ የማወቂያ ገደብ እና ጥሩ የመድገም ችሎታ አላቸው። የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ የሚያስፈልጋቸው እንደ ፕሮቲን፣ ሜታፕሮቲኦም እና የአንድ ዝርያ ሜታቦሎሜ ባሉ የተለያዩ የምርምር መስኮች ቀስ በቀስ አስፈላጊ መሣሪያዎች ሆነዋል። ለረጅም ጊዜ ተለዋዋጭ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መሳሪያዎች የሜታፕሮቲሞም ምርምር የፕሮቲን ሽፋን ጥልቀት መገደቡን ልብ ሊባል የሚገባው ነው. ለወደፊቱ, ትልቅ ተለዋዋጭ ክልል ያላቸው የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መሳሪያዎች በሜታፕሮቲሞሞች ውስጥ ያለውን የፕሮቲን መለየት ስሜትን እና ትክክለኛነትን ሊያሻሽሉ ይችላሉ.

ለጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መረጃ ማግኛ፣ ምንም እንኳን የዲአይኤ መረጃ ማግኛ ሁነታ በአንድ ዝርያ ፕሮቲን ውስጥ በሰፊው ተቀባይነት ቢኖረውም፣ አብዛኛው የአሁኑ የማክሮ ፕሮቲሞም ትንታኔዎች አሁንም የዲዲኤ መረጃ ማግኛ ሁነታን ይጠቀማሉ። የዲአይኤ መረጃ ማግኛ ሁኔታ የናሙናውን ክፍልፋይ ion መረጃ ሙሉ በሙሉ ማግኘት ይችላል ፣ እና ከዲዲኤ መረጃ ማግኛ ሁኔታ ጋር ሲነፃፀር የማክሮፕሮቲሞም ናሙና የፔፕታይድ መረጃን ሙሉ በሙሉ የማግኘት እድል አለው። ይሁን እንጂ በዲአይኤ መረጃ ውስብስብነት ምክንያት የ DIA macroproteome መረጃ ትንተና አሁንም ከፍተኛ ችግሮች እያጋጠመው ነው. የአርቴፊሻል ኢንተለጀንስ እድገት እና ጥልቅ ትምህርት የ DIA መረጃ ትንተና ትክክለኛነት እና ሙሉነት ያሻሽላል ተብሎ ይጠበቃል።

በሜታፕሮቲሞሚክስ መረጃ ትንተና ውስጥ አንዱ ቁልፍ እርምጃዎች የፕሮቲን ቅደም ተከተል የውሂብ ጎታ ግንባታ ነው. እንደ አንጀት እፅዋት ላሉ ታዋቂ የምርምር ቦታዎች እንደ IGC እና HMP ያሉ የአንጀት ማይክሮቢያል ዳታቤዞችን መጠቀም ይቻላል እና ጥሩ የመለያ ውጤቶች ተገኝተዋል። ለአብዛኛዎቹ ሌሎች የሜታፕሮቲኦሚክስ ትንታኔዎች፣ በጣም ውጤታማው የውሂብ ጎታ ግንባታ ስትራቴጂ አሁንም በሜታጂኖሚክ ቅደም ተከተል መረጃ ላይ የተመሠረተ ናሙና-ተኮር የፕሮቲን ቅደም ተከተል ዳታቤዝ ማቋቋም ነው። ከፍተኛ ውስብስብነት እና ትልቅ ተለዋዋጭ ክልል ላለው ማይክሮቢያል ማህበረሰብ ናሙናዎች ዝቅተኛ የተትረፈረፈ ዝርያዎችን ለመለየት, የፕሮቲን ቅደም ተከተል ዳታቤዝ ሽፋንን ለማሻሻል የዝርዝር ጥልቀት መጨመር አስፈላጊ ነው. ተከታታይ ውሂብ ሲጎድል፣የህዝብ ዳታቤዝ ለማመቻቸት ተደጋጋሚ የፍለጋ ዘዴ መጠቀም ይቻላል። ነገር ግን፣ ተደጋጋሚ ፍለጋ የFDR ጥራት ቁጥጥርን ሊጎዳ ይችላል፣ ስለዚህ የፍለጋ ውጤቶቹ በጥንቃቄ መፈተሽ አለባቸው። በተጨማሪም፣ የባህላዊ የኤፍዲአር የጥራት ቁጥጥር ሞዴሎች ተፈፃሚነት በሜታፕሮቲኦሚክስ ትንታኔ አሁንም መፈተሽ ተገቢ ነው። የፍለጋ ስትራቴጂን በተመለከተ የዲአይኤ ሜታፕሮቲኦሚክስ ሽፋን ጥልቀትን ለማሻሻል የድብልቅ ስፔክትራል ቤተ መፃህፍት ስትራቴጂ። በቅርብ ዓመታት ውስጥ፣ በጥልቅ ትምህርት ላይ የተመሰረተው የተተነበየው ስፔክትራል ቤተ-መጽሐፍት በDIA ፕሮቲዮሚክስ የላቀ አፈጻጸም አሳይቷል። ይሁን እንጂ የሜታፕሮቲሞም ዳታቤዝ ብዙውን ጊዜ በሚሊዮኖች የሚቆጠሩ የፕሮቲን ምዝግቦችን ይይዛሉ, ይህም ከፍተኛ መጠን ያላቸው የተገመቱ ስፔክትራል ቤተ-መጻሕፍትን ያስከትላል, ብዙ የኮምፒዩተር ሀብቶችን ይጠቀማል እና ትልቅ የፍለጋ ቦታን ያመጣል. በተጨማሪም, በሜታፕሮቲሞሞች ውስጥ ባሉ የፕሮቲን ቅደም ተከተሎች መካከል ያለው ተመሳሳይነት በጣም የተለያየ ነው, ይህም የስፔክትራል ቤተመፃህፍት ትንበያ ሞዴል ትክክለኛነት ለማረጋገጥ አስቸጋሪ ያደርገዋል, ስለዚህም የተገመቱ ቤተ-መጻሕፍት በሜታፕሮቲዮሚክስ ውስጥ በስፋት ጥቅም ላይ አልዋሉም. በተጨማሪም፣ በከፍተኛ ቅደም ተከተል የሚመሳሰሉ ፕሮቲኖችን በሜታፕሮቲኦሚክስ ትንታኔ ላይ ተግባራዊ ለማድረግ አዲስ የፕሮቲን ኢንቬንሽን እና ምደባ ማብራሪያ ስልቶችን ማዘጋጀት ያስፈልጋል።

በማጠቃለያው፣ እንደ አዲስ የማይክሮባዮም ምርምር ቴክኖሎጂ፣ ሜታፕሮቲኦሚክስ ቴክኖሎጂ ከፍተኛ የምርምር ውጤቶችን ያስመዘገበ ሲሆን እንዲሁም ትልቅ የእድገት አቅም አለው።